【コラム】IC-PADによるプレバイオティクスの分析:AOAC 2001.02の改良
2021/03/22
記事
情報共有
私たちの食生活は、健康にとって極めて重要です。ここ数年、β-ガラクトオリゴ糖(GOS)のようなプレバイオティクスなど、食品添加物や栄養補助食品への関心が高まっています。厳格な食品表示・安全要件を満たすには、食品やサプリメント中の全GOS含有量の決定が不可欠です。全GOS決定に最も広く使用されている方法は、クロマトグラフィー分析前に、複雑な分子を単純な炭水化物へと分解する酵素加水分解に基づいています。本記事では、AOAC法2001.02を、アンペロメトリック検出を伴うイオンクロマトグラフィー(IC-PAD)と、酵素加水分解後のサンプル完全自動化により改良することの利点について概説します。
GOSとは何ですか?
GOSは、末端にグルコースを持つ場合もあるガラクトース単位の鎖です。これらは多くの場合、さまざまな食品や飲料中に少量ながら自然に存在しています。
当初、人間の母乳の主要成分として発見され(最大12 g/L存在)、GOSはプレバイオティクスサプリメントとして乳児用調製粉乳に添加されています。これらはビフィズス増殖効果を示します。つまり、非病原性の腸内細菌の増殖と健康をサポートします。
GOSサプリメントは、原料のまま、あるいは濃縮パウダーやシロップとして入手可能であり、その後、食品製造業者によって消費者向け製品を強化するために使用されるか、またはサプリメントとして販売されます。
GOSの表示要件
世界のプレバイオティクス・GOS市場の継続的な成長は、健康的な食事に関する消費者の意識の高まりの結果です。同様に、食品品質に対する需要の高まりは、食品表示・安全性に関するより厳格で包括的な規則(例:EU 1169/2011やEU 2015/2283)につながっています。したがって、食品、サプリメント、または原材料中の全GOS含有量の決定は、このような要件を満たすために不可欠です。
GOSの健康効果に関する研究では、1日あたり30 g未満の最大摂取量が推奨されていますが、乳児用調製粉乳についてはこれよりもはるかに厳しい基準が設けられています。それ以外には、食品中または栄養補助食品中のGOS含有量に関する他の上限は特に設けられていません。
AOAC 2001.02
食品製品中の全GOSを測定するために最も広く使用されている方法は、標準法であるAOAC 2001.02です。この方法は、サンプルからのGOS抽出、それに続くオリゴ糖の単糖への酵素加水分解、そしてパルスドアンペロメトリック検出を伴う高性能陰イオン交換クロマトグラフィーによるその後の分析に基づいています。
AOACでは、陰イオン用クロマトグラフィーはHPAEC(高性能陰イオン交換クロマトグラフィー)と呼ばれていますが、本記事では一般的な用語であるICに簡略化します。
AOAC 2001.02の要点は、対照溶液と、酵素(β-ガラクトシダーゼ)で処理・加水分解された溶液との比較です。この酵素は、配糖体結合の分解を触媒し、GOSおよびラクトースをグルコースとガラクトースへと加水分解します。これら2つの溶液で決定される遊離ガラクトースおよびラクトースの濃度差が、全GOSの算出に使用されます(図1)。
AOAC法の改良点
AOAC 2001.02のサンプル前処理はかなり複雑です:欠点の一つは、純粋な抽出液を使用する代わりに、(かなり高価な)失活酵素を用いた参照溶液のインキュベーションにより初期炭水化物濃度を決定することです(図1)。もう一つの重要な点は、標準物質が超純水を基にしているのに対し、サンプル希釈手順はアセトニトリルで行うことになっている点です。
ここでは、使いやすさと方法全体の効率を高めるため、手順全体を簡略化することに焦点が当てられました。
全GOS含有量分析の改良された方法では、初期グルコース、ガラクトース、およびラクトース濃度の測定に抽出液が使用されます(図1、アッセイ1)。しかしながら、失活酵素は使用されず、その代わりに、その存在が結果に何らかの影響を与えるかどうかを確認するための比較が行われました。この段階は、AOAC 2001.02のアッセイ1(失活酵素あり)と同等の結果が実証された後に廃止されましたが、薬品コストと追加の手作業は削減されます。したがって全GOS含有量は、アッセイ1(酵素なし)とアッセイ2(活性酵素を含む抽出液)における分析種濃度から算出されます(図2)。
本アプリケーションについての詳細は、イオンクロマトグラフィーによる食品中の全GOS分析に関する下記アプリケーションノートをご参照ください。
酵素の使用に加え、全GOS分析の公式AOAC法では、サンプルは20%アセトニトリルで希釈することとされている一方、標準物質は超純水(UPW)で調製することが提案されています。以下の結果を比較するため、対照実験が実施されました:
- UPWで希釈し、UPW校正で評価(「UPWオプション」)
- アセトニトリルで希釈し、UPW校正で評価(AOAC 2001.02)
- アセトニトリルで希釈し、アセトニトリル校正で評価(「ACNオプション」)
全GOS含有量の再現性が3つのオプション間で比較され、UPWおよびAOAC調製オプションは類似した結果を示しました。ACNオプションは、他のオプションよりも低い全GOS含有量をもたらしました。さらに、アセトニトリルはサンプルに対する安定化効果をもたらさないようでした。これは、アセトニトリルの代わりにUPWでサンプル希釈を行うことによるAOAC法の改良を裏付けるものであり、不要な試薬の節約と、分析における化学的な痕跡の抑制につながります。
結果
全体として、良好な変動性、ターゲット回収率およびスパイク回収率、そして干渉試験により、改良された方法が価値があり堅牢であることが実証されました。溶液中でガラクトース0.1 mg/L、グルコース・ラクトース0.2 mg/Lという検出限界(LOD)により、低い全GOS含有量であっても高精度で決定することが可能です。
まとめ
複数成分を対象とする方法として、アンペロメトリック検出を伴うイオンクロマトグラフィーは、追加の誘導体化段階を必要とせず、炭水化物に対して非常に選択的で高感度、かつ堅牢な分析方法です。酵素処理と組み合わせることで、より複雑な炭水化物であっても定量することが可能です。
本研究は、食品中の全GOS決定に関する標準AOAC法の改良を提示しています。同じ原理(複雑なGOS分子の酵素加水分解、それに続く単純な炭水化物のクロマトグラフィー分析)のもとで、分析法の効率が向上し、実験室での時間や運用コストの削減につながりました。追加の自動化段階(例:Metrohm Inline Dilutionおよび自動校正)により、方法の効率をさらに高めることができます。
IC-PADによる全GOS簡略化法についての詳細をお求めですか?AOAC法2001.02の改良―手作業の削減と高価な試薬の排除について、LC/GCのThe Column誌(2021年)に掲載された記事に詳しく記載されています:AOAC 2001.02の改良:HPAEC-PADによる食品中のGOS決定
お役立ち情報
Quality labels for novel foods – Improvement on AOAC 2001.02: GOS analysis with IC-PAD
Read our article in LC/GC The Column (2021)
Metrohm Inline Sample Preparation (MISP) for difficult sample matrices
