【コラム】イオンクロマトグラフィー(IC)における分離カラムのベストプラクティス―第3部
2022/03/21
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本記事は、イオンクロマトグラフィーカラムの適切な使用に関するヒントとコツをお届けする本シリーズの、第3部にして最終回です。第1部では、主にカラムの標準操作条件と操作限界について取り上げ、第2部では、用途に関連するトピックと、分離性能を調整するために変更できる溶出パラメータについて焦点を当てました。本シリーズの締めくくりとなる本記事では、カラムの寿命全体にわたり性能を評価する方法をより詳しく見ていき、発生しうる問題の解決に役立ついくつかのトラブルシューティングのヒントをご紹介します。
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主要なカラムパラメータ
まずは、カラム性能を判断するために使用できる主要なパラメータを見ていきましょう。これらの参照値のほとんどは、分析証明書から確認することができます。分離用カラムの証明書は、Metrohm Certificate Finderでご覧いただけます。カラム性能を検証するため定期的に証明書のクロマトグラムを再現することは、性能の変化を早期に検出し、カラムの不可逆的な損傷を回避するのに役立ちます。
以下では、最も重要なパラメータを一つずつ見ていきます。
保持時間とカラム容量
個々の分析種の保持時間は、カラムの選択性と容量を示す良い指標です。分析種の保持時間が証明書の保持時間と一致しない場合、この挙動にはさまざまな理由が考えられます。
まず考えられるのは、溶離液成分が正しい濃度で存在しないなどの理由により、溶離液組成が誤っている可能性です。溶離液強度が高すぎる場合、保持時間は短縮されます。この現象は通常すべてのイオンで同時に起こり、すべてのピークをより近づけます。この際、多価イオンは一価イオンよりも強く加速されます。この問題は、正しい組成の新しい溶離液を調製することで解決できます。
溶離液が新鮮でない、あるいはCO2アドソーバーなどにより周囲の大気から十分に保護されていない可能性もあります。大気中の二酸化炭素は、時間の経過とともに溶離液組成(すなわち強度、pHなど)を変化させ、これが分析種の保持時間に影響を与えます。炭酸イオンの溶出強度は水酸化物イオンよりもはるかに強いため、弱い水酸化物溶離液は特にこの問題の影響を受けやすく、保持時間の大きな変動につながります。したがって、多価イオンは一価イオンよりもこの影響を受けやすくなります。この問題は、新しい溶離液を調製し、CO2アドソーバーを使用することで解決できます。水酸化物溶離液を使用する場合、水酸化物ストック溶液が大気中のCO2を吸収する可能性があるため、その状態を確認することも重要です。図1は、大気からのCO2取り込みが一般的な陰イオンの保持時間に与える影響を示しています。
一部のサンプルには、カラム材料のイオン交換基を占有する成分が含まれている場合があります。この場合、カラム上で利用可能なイオン交換基の数が初期状態と比較して減少し、見かけ上のカラム容量の低下と保持時間の短縮につながります。汚染物質の種類によっては、この影響を反転させ、カラム表面から洗い流すことができる可能性があります。これらの再生手順は、それぞれの固定相に個別に適合されており、カラムを救済するための最後の手段として使用すべきです。
手順および操作限界は、各カラムのマニュアルに記載されており、当社ウェブサイトでご覧いただけます。再生手順を実施する前に、お近くのMetrohm販売店にご相談ください。
- 汚染が多価イオンによるものである場合、通常はより高濃度の溶離液でカラムをフラッシュすることで洗い流すことができます。この際、特に溶離液pHに関するカラムの操作限界を忘れないようにしてください。
- 場合によっては、有機分子がカラム固定相への強い親和性のため、そこに吸着することがあります。これはイオン交換基の閉塞、そして保持時間の短縮と操作圧力の上昇につながる可能性があります。この場合、有機修飾剤を一部含む溶離液で固定相を洗浄することが役立ちます。これにより、汚染物質の移動相への親和性が高まり、固定相からの脱離を助けます。
通常、こうした再生手順の後、元のカラム容量を回復させることができます。
分離用カラムの寿命を延ばすさらに優れた方法は、ガードカラムを定期的に交換することです。その目的の一つは、汚染物質を捕捉することで分離用カラムを保護することです。
分離用カラムの寿命中に、ガードカラムを3~4回交換するようにしてください。染料や食品マトリックスのような非常に複雑なサンプルマトリックスを扱う場合は、さらに頻繁に交換してください。このような状況では、Metrosep RP 2 Guard/3.5の使用をお勧めします。
図2のクロマトグラム重ね合わせは、不良なガードカラムがピーク形状に与える影響を示しています。
場合によっては、固定相の化学的な変化によりカラム容量が低下することがあります。これは、極端なpH条件のような、操作限界を超える条件下でカラムが使用された場合に起こります。極端なpH条件は、イオン交換基と基材粒子基板との間の化学結合を変化させる可能性があります。この不可逆的なプロセスは、永続的なカラム容量の損失につながります。この場合、いかなる再生手順によっても元のカラム容量を回復させることはできません。
このイオン交換基の損失は、イオン交換カラムの通常の使用中にもゆっくりと生じることにご留意ください。イオン交換基の化学結合の強度は、長いカラム寿命を提供するため、Metrohmカラムの開発中に徹底的に試験されています。
理論段数とピーク対称性
理論段数(TP)は、カラムの充填状態を判断するための有用なツールとなります。TP値が高いほど、カラムの充填状態は良好です。カラム充填床の意味ある判断のためには、クロマトグラム中であまりに早く溶出しない(こうしたピークは、特に2 mmシステムでは、カラム外効果の影響を受ける可能性があります)、かつ二次的相互作用の影響を受けない(すなわち硝酸塩の使用は避ける)分析種を選択してください。陽イオンにはカリウムが、陰イオンには硫酸塩が、適した選択肢です。
カラムは通常の操作圧力よりも高い圧力で充填されますが、充填床は、移動相(溶離液)の連続的な流動とともに、カラムの寿命全体を通じてさらに緻密化し続けます。この効果により固定相の充填床は改善する一方、分離用カラムの入口にある程度のデッドボリュームが生じる可能性もあります。このデッドボリュームは、特にクロマトグラムの初期において、ピークの広がりや理論段数の低下の原因となりえます。
これはカラムの通常の経年劣化プロセスですが、カラムを丁寧に扱うことでその進行を遅らせることが可能です。予防措置には、起動時の溶離液流量・温度のゆっくりとした開始、そしてカラムを取り外す前の高圧ポンプの適切かつ完全な停止が含まれます。機械的ストレスは充填床に有害となる可能性があるためです。ガードカラムの交換は、しばしば理論段数やピーク形状に良い影響を与えることがあります(図2参照)。
カラム充填床の問題は、しばしば非対称性係数値や全体的なピーク形状にも表れます。より顕著なフロンティングやピークの広がりは、カラムまたはガードカラムにおけるチャネリングの警告サインとなりえます。残念ながら、この種のカラムの損傷は不可逆的であり、分離用カラムの交換が必要です。
カラムを交換する前に、クロマトグラムでピークの広がりが観測された場合、その問題がカラムに由来するものか、あるいはICシステム内の他の接続部分に由来するものかを確認することが重要です。高圧経路内のすべてのキャピラリーの径が0.25 mm以下であること、そしてすべてのキャピラリーが余分なデッドボリュームなく正しく設置・接続されていることを確認してください。小さな内径(2 mm、マイクロボア)のカラムを備えたシステムは、4 mmカラムを備えたシステムよりもデッドボリュームの影響を強く受けます。これはつまり、マイクロボアカラムを使用する場合、4 mmカラムを使用する場合と比較して、ピークの広がりの影響が目に見えるようになるまでに必要なデッドボリュームが少なくて済むことを意味します。
カラム圧力
カラムの寿命全体を通じて定期的に確認すべきもう一つの重要なパラメータは、システム圧力です。高圧は、カラム交換に至る最も頻繁な原因の一つです。圧力上昇が確認された際は必ず、ICシステムのどの部分が原因であるかを確認することが重要です。
サンプルに粒子が含まれており、サンプル前処理が不十分な場合、粒子は保護用ガードカラムの入口に蓄積し、最終的にシステム圧力の上昇につながります。この場合、ガードカラムは分離用カラムを保護するという本来の目的を果たしており、交換が必要です。ガードカラムの交換が十分早く行われない場合、粒子状の汚染物質が通り抜け、分離用カラムに負荷をかける可能性があります。粒子が付着したガードカラムに再生手順はありませんが、粒子で汚染された分離用カラムは、低流量で逆方向にカラムをすすぐことで再生できる場合があります。
これらの再生手順は、必ずしも成功するとは限らないことにご留意ください。
ICシステムの高圧経路に粒子が注入されるのを避けることは、ガードカラムと分離用カラムを保護する良い方法です。Metrohmは、カラムの寿命に良い影響を与える複数の自動サンプル前処理技術を提供しています。この目的で最も一般的な技術は、Inline Ultrafiltration(図3)とInline Dialysisです。
Metrohm Inline Ultrafiltrationについて詳しくは、関連するブログ記事をご覧ください。
カラムの寿命終了
上記で説明したすべてのパラメータは、カラム(およびICシステム)の性能を判断するために考慮すべきです。これらのパラメータの多くは、MagIC Netソフトウェアにおいて綿密に監視することができ、これにより潜在的な問題をできるだけ早期に検出することができます。
Metrohm製ICカラムは非常に長い寿命を持つよう設計・製造されていますが、いずれは性能が低下し、再生手順を用いても、用途のニーズを満たすために必要なカラム性能を回復できなくなることがあります。これはカラムの寿命終了を意味し、分離用カラムの交換は避けられなくなります。
Metrohm製分離用カラムはリサイクルすることができず、通常の廃棄物として処分することができます。しかしながら、測定されたサンプルや使用された化学物質の種類、そしてそれに伴う危険性によっては、適切な廃棄方法を検討する必要がある場合があります。
サンプルの性質にかかわらず、いかなる時もカラムを開けないでください。
トラブルシューティング概要
表1は、カラム性能の挙動を確認する際の、特定のトラブルシューティング戦略についての概要を示しています。
表1. ICカラムにおける性能低下の防止・是正
| 指標 | 原因 | 予防・是正措置 |
|---|---|---|
| 背圧の上昇 | ガードカラム上の粒子 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離用カラム上の粒子 | 分離用カラムを逆方向の流れですすいでください
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| サンプル中の粒子 | サンプル前処理(例:Inline Ultrafiltrationによる粒子の除去) | |
| 保持時間の短縮 | 溶離液中の炭酸塩 | 大気中の二酸化炭素は、溶離液中の炭酸塩/炭酸水素塩の平衡に影響を与えます。炭酸塩/炭酸水素塩溶離液は経時的に弱まり、水酸化物溶離液は強まります。
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| 溶離液中の気泡 | 気泡は溶離液の流れを不安定にします。背圧は流れの不安定性の指標です。±0.1 MPaの範囲内で安定しているべきです。
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| 高原子価イオンによるカラムの容量低下 | 無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 分解能の低下 | 溶離液が古い、または誤って調製された | 溶離液は新鮮に調製すべきです。正しく調製されていること、特に炭酸塩と炭酸水素塩が混同されていないことを確認してください。 |
| ガードカラムに堆積した汚染物質の吸着効果 | ガードカラムを交換してください。 | |
| 分離用カラムに堆積した汚染物質の吸着効果 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 理論段数の低下 | ガードカラムの汚染 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離用カラムの汚染 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 | |
| 分離用カラムの過負荷 | サンプルマトリックス中の高い塩分含有量などの要因により、分離用カラムが過負荷になることがあります。
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| ICシステム内のデッドボリューム |
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| 非対称性 | ガードカラムのデッドボリュームまたは汚染 | ガードカラムを交換してください。 |
| 分離用カラムの汚染 | 有機性・無機性の堆積物を除去するため、カラムリーフレットに従ってカラムを再生してください。 |
まとめ
本記事では、ICカラムの寿命全体を通じて、その性能をどのように評価・監視できるか、そして長いカラム寿命を確保するためにどのような対策を講じられるかについて説明しました。これをもちまして、「イオンクロマトグラフィーにおける分離用カラムのベストプラクティス」シリーズを締めくくります。さらにご質問がございましたら、お近くのメトロームIC営業担当までお気軽にお問い合わせください。
